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吡那地尔通过直接结合HSP90抑制CMA对CRT的降解

研究背景

吡那地尔是一种抗高血压药物，可以直接放松血管平滑肌细胞(VSMCs)，促进外周血管舒张。有研究表明吡那地尔预处理可以冠状动脉舒张，保护缺血心脏免受再灌注损伤。

心脏微血管缺血再灌注损伤是一种与心脏疾病相关的严重并发症。相当一部分患者在经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后出现心脏微血管功能障碍，导致心肌再灌注无效，加剧心肌损伤，导致重大心血管不良事件发生。吡那地尔除了具有松弛 VSMC 的作用外，对内皮细胞在心血管损伤中的机制尚未进行研究。考虑到内皮细胞是心脏微血管的解剖和功能基础，研究吡那地尔在内皮细胞和心血管保护中的作用具有重要意义。

文献来源

复旦大学附属中山医院陈章炜、钱菊英和葛均波院士团队在期刊《Basic Research in Cardiology》上发表题为“Pinacidil ameliorates cardiac microvascular ischemia–reperfusion injury by inhibiting chaperonemediated autophagy of calreticulin”的研究论文，研究结果发现吡那地尔治疗和 CRT 过表达均对心脏微血管 I/R 损伤具有保护作用，吡那地尔直接与 HSP90 结合，通过 HSP90 抑制 CRT 分子伴侣介导的自噬 (CMA) 降解， 从而维持线粒体钙稳态，最终保护心脏微血管减轻 I/R 损伤。这些发现揭示了吡那地尔心血管保护的新机制，并提示CRT/钙超载/线粒体凋亡信号通路是内皮损伤的潜在病理机制。

研究结果

首先，研究人员对术后的假手术组、I/R损伤组和I/R+吡那地尔组（0.1和0.5 mg/kg/天）小鼠进行了超声检查心脏功能发现，吡那地尔治疗可以有效改善I/R损伤造成的心脏功能障碍。接下来，研究人员使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、WB和TTC染色等组织病理学检查发现，吡那地尔给药显著减少了I/R损伤后的心脏的梗死面积、内皮细胞凋亡损伤和心室重塑，这些结果表明，吡那地尔治疗至少部分可以通过改善心脏细胞凋亡来减轻缺血再灌注引起的心脏功能障碍和重塑。

图1 吡那地尔给药可改善 I/R 小鼠模型的心脏功能

血管血液灌注在心脏修复中发挥重要作用。因此，研究人员为了确定吡那地尔在 I/R 损伤后血管功能中的具体作用。使用硫代黄素S染色测量未回流区域发现，吡那地尔可以有效改善I/R损伤带来的左心室缺损，增加毛细血管密度和灌注情况，减轻无复流现象。研究人员还发现 I/R 损伤后导致心脏微血管中 NO 生成显着减少、内皮素 1(ET1)表达上调、内皮 NO 合酶(eNOS)表达下调以及磷酸化。WB验证、免疫荧光实验和蛋白泄露实验检测结果显示，吡那地尔可以明显改善I/R损伤带来的内皮屏障功能障碍和内皮依赖性炎症来保护微血管功能免受心脏缺血再灌注损伤。

图2 吡那地尔治疗可减轻I/R损伤小鼠模型中的心脏微血管功能障碍

为了阐明吡那地尔在内皮保护中的潜在机制，研究者对OGD/R 损伤后 HCMEC 的细胞进行了评估，发现OGD/R 损伤后HCMEC细胞凋亡能力显著增强，与线粒体相关凋亡蛋白Bax、Caspase 9和cleavedCaspase 3表达显著增加，同时会释放细胞色素C(CytC)到细胞质中，吡那地尔治疗可以有效改善OGD/R损伤对HCMEC细胞影响。

与体内研究结果一致，吡那地尔给药还可以很大程度恢复由于OGD/R损伤导致细胞培养基中NO的含量以及eNOS表达和磷酸化的降低，并且明显减轻了内皮炎症反应、FITCBSA渗漏和改善βcatenin 和 VEcadherin的强度和形态，以上结果表明吡那地尔可以部分通过抑制线粒体依赖性细胞凋亡，对内皮保护的有益作用。

图3 吡那地尔可改善OGD/R损伤中的HCMEC功能和存活率

对OGD/R 损伤的 HCMEC 进行了转录组学测序分析，GO注释结果显示DEG主要富集在与线粒体功能、ER应激途径和钙相关途径通路中。于是研究人员通过实时钙信号报告基因 GCaMP8 记录钙超载情况，发现I/R损伤后中小鼠心脏内皮细胞的钙超载被激活，吡那地尔可以显着降低 I/R 心脏中的荧光强度。钙稳态主要由钙通道成员以及内质网和线粒体之间的穿梭调节，因此研究人员检测发现 OGD/R 损伤的 HCMEC 中膜钙通道调节因子 MCU 和 IP3R 水平显着升高，同时降低线粒体钙水平的 SERCA2 表达水平显着降低，而吡那地尔治疗可明显逆转这种情况。此外，吡那地尔治疗治疗还可以显著减少内质网和线粒体的重叠区域(称为MAM)。综上所述，吡那地尔对线粒体损伤的保护作用很大程度上取决于减少钙从内质网到线粒体的穿梭，可能是通过调节 MCUIP3RsSERCA2 途径和 MAM 形成。

图4 吡那地尔治疗可减少OGD/R损伤后的钙超载

为了进一步探索吡那地尔在内质网线粒体钙穿梭中潜在的分子机制。研究人员以内质网的钙缓冲剂CRT为着手点，体内实验发现OGD/R损伤上调CRT蛋白表达，吡那地尔给药以剂量依赖性方式促进CRT蛋白表达并增加小鼠I/R心脏血管内皮中的CRT表达。不过体外实验发现发现，吡那地尔治疗并没有增加OGD/R损伤后HCMEC细胞中CRT基因mRNA上调，因此，吡那地尔可能调节 CRT 蛋白的稳定性和降解。研究人员通过放线菌酮 (CHX) 处理发现，吡那地尔可在正常和 OGD/R 条件下维持 CRT 蛋白表达，表明吡那地尔抑制 CRT 蛋白降解。然后通过评估蛋白酶体和溶酶体抑制剂对CRT蛋白水平的变化，发现吡那地尔可以减少 OGD/R 损伤后 CRT 的自噬降解。DARTS(药物亲和响应靶稳定性)、LCMS 分析和WB实验结果显示，吡那地尔可以直接结合HSP90，并且显著降低溶酶体和细胞质中CRT与HSP90之间的相互作用。因此，抑制 HSP90 介导的 CMA 降解 CRT 可能是吡那地尔对内皮钙稳态有益的潜在分子机制之一。

图5 吡那地尔抑制OGD/R 损伤中CRT的CMA

通过对HCMEC细胞进行过表达CRT蛋白发现，CRT过表达对钙超载没有影响。然而，在OGD/R损伤后，CRT过表达保护HCMEC免受线粒体和细胞钙超载的影响，显示出与吡那地尔治疗相同的结果，OGD/R损伤后，钙通道IP3Rs和MCU被CRT过表达下调，表明从ER转移到线粒体的钙减少了。随着线粒体膜电位的改善，表明CRT过表达可以改善线粒体功能障碍。线粒体功能改善后，检测到线粒体相关的细胞凋亡指标发现，OGD/R损伤后，CRT过表达限制Cytc释放到细胞质中，下调Bax和Caspase9表达，上调Bcl2表达，表明CRT在线粒体相关细胞凋亡中的抑制作用。综上所述，CRT 通过维持钙稳态、改善线粒体功能和抑制线粒体凋亡，对内皮保护免受 OGD/R 损伤产生积极作用。

图6 CRT 过表达可减轻OGD/R损伤的HCMEC中的钙超载和线粒体功能障碍

为了进一步验证CRT在内皮钙稳态和心脏微血管保护中的作用，使用了AAV9介导的内皮特异性CRT过表达小鼠模型。与前文吡那地尔治疗结果相似，CRT过表达显着降低了I/R损伤小鼠中GCaMP8的荧光强度，减少了内皮细胞凋亡，增强了毛细血管密度和灌注，并减轻了I/R损伤后的无复流现象，降低梗塞面积并改善了心脏功能。

图7 内皮特异性CRT过表达可减轻心脏微循环损伤并减少 I/R 损伤中的梗塞面积

综上所述， 吡那地尔通过直接结合HSP90抑制CMA对CRT的降解。另外，上调CRT表达可通过IP3Rs/MCU信号通路抑制钙超载诱导的线粒体功能障碍和线粒体依赖性凋亡，最终改善内皮功能和心脏微血管I/R损伤。

原文引用：“CRToverexpressing adenoassociated virus serotype 9(AAV9CRT)genomic particles were obtained from Genomeditech (Shanghai, China).

Lentiviruses encoding the CRT sequence(LVCRT), short hairpinCRT(LVshCRT), or negative control (LVNC)were purchased from Genomeditech(Shanghai, China). ”

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